Trzydzieści cztery litery zamka: jak działają modele przewidujące prezentację antygenu

W poprzednim wpisie opisaliśmy, jak powstaje zindywidualizowana szczepionka mRNA na raka: z guza konkretnego pacjenta wybiera się do 34 fragmentów zmutowanych białek i to one trafiają do preparatu. Wyboru nie dokonuje człowiek — dokonuje go program. Poświęciliśmy mu tam pięć akapitów i było to o wiele za mało, bo właśnie w tym miejscu uczenie maszynowe podejmuje jedyną prawdziwą decyzję w całym procesie: co znajdzie się w szczepionce.

Ten artykuł jest w całości o tym jednym kroku. Jest dłuższy i bardziej szczegółowy niż poprzedni, ale nie zakłada żadnej wiedzy z biologii — zaczynamy od zera, od wyjaśnienia, czym są cząsteczki, o których będzie mowa. Po drodze prostujemy też jedną liczbę z poprzedniego tekstu.

Zanim zaczniemy: co to wszystko znaczy

Cała ta dziedzina opiera się na jednym mechanizmie biologicznym. Warto zrozumieć go raz, porządnie, bo dalej wszystko będzie się do niego odwoływać.

Białko to długi łańcuch zbudowany z aminokwasów. Rodzajów aminokwasów jest dwadzieścia i każdy ma przypisaną literę, więc białko można zapisać jak słowo — tyle że słowo długie na setki liter. Zbiór wszystkich białek, jakie potrafi wyprodukować ludzka komórka, nazywa się proteomem.

Komórka bez przerwy niszczy część własnych białek: zużyte, uszkodzone albo po prostu nadmiarowe. Zajmuje się tym proteasom — molekularna niszczarka w kształcie beczki, która wciąga łańcuch białkowy i tnie go na krótkie kawałki. Taki kawałek, długi zwykle na osiem do czternastu liter, nazywamy peptydem.

I tu zaczyna się rzecz najciekawsza. Część peptydów nie idzie na przemiał, tylko zostaje wystawiona na powierzchni komórki, jak próbka wywieszona za okno. Zajmuje się tym osobne białko, u człowieka nazywane HLA (od human leukocyte antigen; ta sama rodzina białek u innych gatunków występuje pod nazwą MHC i oba skróty bywają używane wymiennie). Cząsteczka HLA ma na wierzchu rowek — podłużne wgłębienie między dwiema spiralnymi ściankami — i trzyma w nim jeden peptyd, zwrócony na zewnątrz komórki.

Po co komórka to robi? Ponieważ obok krążą limfocyty T, komórki odpornościowe, których zadaniem jest oglądanie tych próbek. Limfocyt ma na powierzchni receptor dopasowany do jednego konkretnego kształtu. Jeśli receptor rozpozna wystawiony peptyd jako obcy, limfocyt zabija komórkę. Tak właśnie organizm wykrywa komórki zakażone wirusem i komórki nowotworowe: nie ogląda ich wnętrza bezpośrednio, tylko czyta próbki tego, co się w nim znajduje.

A teraz sedno problemu. Gen kodujący HLA występuje w populacji w tysiącach wariantów, i taki wariant nazywamy allelem. Warianty różnią się niemal wyłącznie kształtem rowka — a skoro rowek ma inny kształt, mieszczą się w nim inne peptydy. Dlatego ta sama komórka, ten sam wirus i ten sam nowotwór wyglądają inaczej dla układu odpornościowego dwóch różnych osób. Każdy z nas ma trzy geny HLA klasy I, nazywane A, B i C, po dwie kopie każdego — czyli najwyżej sześć różnych alleli, sześć różnych rowków, wylosowanych przy poczęciu z katalogu liczącego dziesiątki tysięcy pozycji.

Zostają dwa słowa, których będziemy używać stale. Peptyd, który rzeczywiście siedzi w rowku danego allelu, to jego ligand. A motyw allelu to opis jego gustu: które aminokwasy lubi widzieć na których pozycjach peptydu. Motyw rysuje się zwykle tak, że im ważniejsza litera na danej pozycji, tym większa.

Jak czytać: podwójna pozioma linia to błona komórki — pod nią wnętrze, nad nią świat zewnętrzny. 1: białko, czyli łańcuch aminokwasów. 2: proteasom, który tnie je na kawałki. 3: powstałe peptydy. 4: cząsteczka HLA osadzona w błonie, trzymająca jeden peptyd w rowku i wystawiająca go na zewnątrz. 5: limfocyt T, który zielonymi widełkami — receptorem — sprawdza, co zostało wystawione. Cały ten artykuł dotyczy przewidzenia kroku 4: czy dana para peptyd–HLA w ogóle się tam pojawi.

Dla porządku, wszystko w jednym miejscu:

pojęcie	znaczenie
peptyd	krótki fragment białka, 8–14 aminokwasów
proteom	zbiór wszystkich białek, jakie komórka może wyprodukować
proteasom	„niszczarka" tnąca białka na peptydy
HLA (MHC)	białko wystawiające peptyd na powierzchni komórki
rowek	wgłębienie w cząsteczce HLA, w którym leży peptyd
allel	jeden z tysięcy wariantów genu HLA; różnią się kształtem rowka
ligand	peptyd, który rzeczywiście leży w rowku danego allelu
motyw	preferencje allelu: jakie aminokwasy lubi na których pozycjach
epitop	peptyd, który faktycznie wywołał odpowiedź limfocytów T

Zadanie, o którym jest ten artykuł, brzmi więc: mając peptyd i mając allel, przewidzieć, czy ta para pojawi się na powierzchni komórki. Reszta tekstu jest o tym, jak się to robi i skąd wiadomo, że działa.

Trzy pytania, które łatwo pomylić

Mówi się skrótowo, że „model przewiduje neoantygeny". W rzeczywistości kryją się za tym trzy różne pytania, ułożone jedno w drugim jak zbiory.

Jak czytać: trzy zagnieżdżone prostokąty to trzy coraz węższe zbiory peptydów, a kropki pokazują, jak szybko ubywa kandydatów w miarę przechodzenia do środka. Niebieski (1) — peptydy, które w probówce zwiążą się z HLA. Złoty (2) — węższy podzbiór: te, które komórka rzeczywiście wystawi. Zielony (3) — jeszcze węższy: te, które limfocyt T naprawdę rozpozna. Ikony po prawej stronie każdego pasa pokazują, co się na danym poziomie bada: dopasowanie do rowka, wystawienie na błonie, kontakt z receptorem.

Pytanie pierwsze — powinowactwo. Czy peptyd zmieści się w rowku i będzie się go trzymał? To pytanie czysto chemiczne: bierzemy oczyszczone białko HLA oraz peptyd i mierzymy siłę wiązania. Można je zadać w probówce, bez udziału żywej komórki.

Pytanie drugie — prezentacja. Czy ten peptyd faktycznie pojawi się na powierzchni żywej komórki? To znacznie więcej niż samo wiązanie, bo po drodze musi się powieść cała sekwencja zdarzeń. Białko źródłowe musi w ogóle powstawać w tej komórce. Proteasom musi wyciąć akurat ten fragment, a nie o dwie litery dłuższy. Pompa białkowa o nazwie TAP musi przetransportować peptyd do wnętrza siateczki śródplazmatycznej — przedziału wewnątrz komórki, czegoś w rodzaju warsztatu, w którym składane są nowe cząsteczki HLA. Tam peptyd musi trafić do świeżo powstającej cząsteczki i związać się z nią na tyle mocno, by kompleks przetrwał podróż na powierzchnię. Wiązanie jest więc warunkiem koniecznym, ale daleko niewystarczającym.

Pytanie trzecie — immunogenność. Czy limfocyt T tego konkretnego pacjenta ma w swoim repertuarze receptor pasujący do tego kompleksu — i czy organizm nie nauczył się wcześniej tolerować tego kształtu? Peptyd, któremu to wszystko się uda, nazywamy epitopem.

Modele opisywane w tym artykule odpowiadają na pytanie drugie. Starsze narzędzia odpowiadały na pierwsze. Na trzecie nikt dziś nie odpowiada dobrze. To rozróżnienie wróci w sekcji o metrykach, bo zestawianie ze sobą narzędzi z różnych poziomów tej piramidy produkuje wykresy, które wyglądają na przełom, a nie znaczą prawie nic.

Trzydzieści tysięcy zamków

Gdyby cząsteczka HLA była jedna, problem byłby banalny: zbieramy peptydy, uczymy program je rozpoznawać, koniec. Kłopot w tym, że HLA jest najbardziej zmiennym miejscem ludzkiego genomu — nigdzie indziej ludzie nie różnią się między sobą tak bardzo.

Na czerwiec 2026 baza IPD-IMGT/HLA nazywa 30 894 allele klasy I: 9 279 dla genu HLA-A, 11 258 dla HLA-B i 9 416 dla HLA-C. Przypomnijmy, że jeden pacjent ma najwyżej sześć z nich. Sześć z trzydziestu tysięcy.

Gdyby dla każdego allelu istniał komplet pomiarów, można by zbudować osobny model dla każdego z osobna. Komplet nie istnieje — i to jest właściwy problem tej dziedziny.

Jak czytać: każdy „uchwyt" na rysunku to jeden allel, czyli jeden wariant cząsteczki HLA. Niebieskie paski ułożone nad uchwytem to peptydy zmierzone dla tego wariantu w laboratorium — im wyższy stos, tym więcej o nim wiadomo. Po lewej trzy najlepiej zbadane allele, podpisane prawdziwymi nazwami. Po prawej reszta katalogu: szare uchwyty, nad którymi nie ma nic, bo nikt nigdy nie zmierzył dla nich ani jednego peptydu. Złota klamra obejmuje mniej więcej 135 alleli mających jakiekolwiek dane, szara — wszystkie 30 894 nazwane. Wysokości stosów i liczba szarych uchwytów są poglądowe; obie liczby przy klamrach są prawdziwe.

Alleli, dla których istnieją jakiekolwiek dane, jest o dwa rzędy wielkości mniej niż alleli nazwanych. Baza MHC Motif Atlas gromadzi ponad milion ligandów — ale rozłożonych na zaledwie 135 cząsteczek klasy I. Referencyjny zbiór pomiarów powinowactwa BD2013 to 176 161 pomiarów dla 114 alleli, i to licząc sześć gatunków, nie tylko człowieka. Dziesiątki tysięcy nazwanych wariantów kontra setka zbadanych.

Rozkład jest przy tym skrajnie nierówny. W automatycznym benchmarku IEDB — standardowym zestawie testowym tej dziedziny — sam allel HLA-A*02:01 stanowi 24,38% zbiorów danych, siedem najczęstszych alleli ponad połowę, a 66,24% cząsteczek klasy I ma sześć zbiorów danych lub mniej. Nie jest przypadkiem, że HLA-A*02:01 jest szczególnie częsty w populacjach europejskich, na których historycznie prowadzono najwięcej badań.

Model uczony osobno dla każdego allelu byłby więc nie tylko niewykonalny. Byłby bezużyteczny dokładnie dla tych pacjentów, którzy najbardziej odstają od próbki treningowej — czyli dla tych, których allele w ogóle nie trafiły do badań.

Zamek opisany liczbami: pseudosekwencja

Rozwiązanie jest proste w pomyśle i sprytne w wykonaniu: niech opis samego zamka będzie częścią wejścia modelu.

Wyjaśnijmy, na czym polega różnica. Model uczony osobno dla każdego allelu dostaje na wejściu tylko peptyd, a wiedza o allelu siedzi w jego wagach — jest osobnym programem dla każdego wariantu. Model pan-specyficzny dostaje dwie rzeczy naraz: sekwencję peptydu i sekwencję rowka. Uczy się wtedy ogólnej reguły „jaki kształt rowka pasuje do jakiego peptydu". Allel, którego nigdy nie widział, przestaje być dla niego nową kategorią — staje się po prostu nowym punktem w tej samej przestrzeni, opisanym tak samo jak wszystkie znane. Na tym polega przedrostek pan- w nazwie NetMHCpan i dzięki temu jeden model obsługuje ponad 11 000 cząsteczek MHC, w tym takie, dla których nie istnieje ani jeden pomiar.

Zostaje pytanie, jak opisać rowek liczbami. Cała cząsteczka HLA klasy I to kilkaset aminokwasów, z czego zdecydowana większość nigdy nie dotyka peptydu — podawanie jej w całości dołożyłoby setki nieinformatywnych liczb.

Autorzy NetMHCpan sięgnęli po struktury krystaliczne, czyli trójwymiarowe mapy cząsteczek odtworzone z obrazu rozpraszania promieni rentgenowskich. Mając taką mapę kompleksu peptyd–HLA, wybrali pozycje spełniające dwa warunki naraz: aminokwas musi leżeć bliżej niż 4 ångstremy od peptydu (ångstrem to dziesięciomiliardowa część metra, więc 4 Å to mniej więcej odległość bezpośredniego dotyku) i musi być polimorficzny, czyli różnić się między allelami. Drugi warunek jest równie ważny jak pierwszy: aminokwas, który dotyka peptydu, ale we wszystkich allelach jest taki sam, nie niesie żadnej informacji o tym, z którym wariantem mamy do czynienia. Pozycji spełniających oba warunki jest 34.

Jak czytać: po lewej rowek HLA oglądany z góry, jakbyśmy patrzyli na niego z zewnątrz komórki. Dwa złote wałki to spiralne ścianki rowka, niebieski łańcuszek pomiędzy nimi to leżący w nim peptyd. Złote kropki to te 34 aminokwasy ścianek, które stykają się z peptydem — dlatego jest ich po siedemnaście z każdej strony. Strzałka oznacza operację wyjęcia tych 34 aminokwasów z cząsteczki i ustawienia ich w jeden szereg: tak powstaje pseudosekwencja, trzydziestoczteroliterowe „imię" allelu, które model dostaje na wejściu obok peptydu. Litery w ramce są przykładowe — to nie jest zapis żadnego konkretnego allelu.

Allel przestaje więc być nazwą w rodzaju „HLA-B*57:01" i staje się trzydziestoczteroliterowym słowem. Rdzeń wejścia sieci to 43 aminokwasy — dziewięć peptydu i trzydzieści cztery rowka.

Każdą literę trzeba jeszcze zamienić na liczby, bo sieć neuronowa nie operuje na literach. Robi się to macierzą BLOSUM50: zamiast jednego numeru aminokwas dostaje wektor dwudziestu liczb mówiących, jak bardzo jest podobny do każdego z pozostałych. Dzięki temu model od pierwszej chwili „wie", że leucyna jest chemicznie bliska izoleucynie, a daleka od kwasu asparaginowego — nie musi się tego uczyć z danych. Daje to 43 × 20 = 860 liczb; w nowszych wersjach dochodzą jeszcze cechy pomocnicze opisane niżej, więc realna warstwa wejściowa jest większa.

Warto się przy tej trzydziestce czwórce zatrzymać, bo w tym cyklu pojawia się drugi raz — i to zupełnie przypadkowo. Poprzedni artykuł mówił o 34 neoantygenach w szczepionce; tamta liczba wynika z długości cząsteczki mRNA, jaką da się wyprodukować. Tutaj 34 to liczba aminokwasów stykających się z peptydem, wynikająca z geometrii białka. Te dwie liczby nie mają ze sobą nic wspólnego — piszemy o tym tylko dlatego, że łatwo wziąć je za zależność.

Peptyd o zmiennej długości w sieci o stałym wejściu

Rowek HLA klasy I jest zamknięty z obu końców, jak wanna — inaczej niż w klasie II, gdzie peptyd może wystawać poza krawędzie. To właśnie ogranicza długość ligandów do 8–14 aminokwasów, przy czym dziewięć jest zdecydowanie najczęstsze. Dwie pozycje robią zwykle najwięcej roboty: druga od początku i ostatnia. Nazywamy je kotwicami — ich boczne odgałęzienia wchodzą w głębokie kieszenie na dnie rowka i to głównie one decydują, czy peptyd się utrzyma. Motyw allelu jest więc zwykle ostry na tych dwóch pozycjach, a rozmyty na pozostałych.

Sieć neuronowa potrzebuje jednak wejścia o zawsze tym samym rozmiarze, a peptydy mają różną długość. Rozwiązanie: wszystko sprowadza się do rdzenia długości dziewięciu.

Peptyd ośmioliterowy dostaje wstawiony sztuczny aminokwas „X", zakodowany jako same zera — czyli miejsce puste, o którym sieć wie, że jest puste. Peptyd dłuższy przechodzi operację odwrotną: wycina się z niego nadmiarowe litery, aż zostanie dziewięć.

Kluczowe jest to, że nie jest to sztywna reguła, tylko przeszukiwanie. Dla peptydu jedenastoliterowego model próbuje wszystkich możliwych sposobów usunięcia dwóch liter — na początku, na końcu i w środku — ocenia każdy wariant osobno i zatrzymuje ten, który dostał najwyższą ocenę. Sieć sama więc ustala, która część peptydu leży w rowku, a która wybrzusza się na zewnątrz. Widać to wprost w wyniku programu: obok oceny podaje on rdzeń, czyli dziewięć aminokwasów w kontakcie z HLA, jego pozycję startową oraz długość i miejsce ewentualnej wstawki lub wycięcia.

Do wejścia dokłada się jeszcze kilka jawnych informacji: długość wstawki lub wycięcia, długość fragmentów wystających poza rowek i samą długość peptydu — tę ostatnią zakodowaną czterema neuronami odpowiadającymi przypadkom L ≤ 8, L = 9, L = 10 i L ≥ 11.

Co siedzi w środku

Tu czeka niespodzianka. Po latach opowieści o uczeniu głębokim można by się spodziewać architektonicznego kolosa. Tymczasem NetMHCpan to sieć z jedną warstwą ukrytą — czyli z jednym „piętrem" neuronów między wejściem a wyjściem.

Warstwa ta liczy 56 albo 66 neuronów; trenuje się obie wersje. Wynik nie pochodzi z pojedynczej sieci, tylko z zespołu — w wersji 4.0 było to sto sieci: dwie architektury × pięć podziałów walidacji krzyżowej × dziesięć losowych początkowych ustawień wag. Ocena końcowa to średnia z całego zespołu, co wygładza wpływ pojedynczego pechowego startu. Dokładnych parametrów wersji 4.1 autorzy nie podali w samym artykule, odsyłając do materiału uzupełniającego.

Jeden szczegół procedury zasługuje na osobną uwagę, bo decyduje o wiarygodności wszystkich publikowanych w tej dziedzinie liczb. Walidacja krzyżowa polega na tym, że dane dzieli się na kilka części, uczy model na wszystkich oprócz jednej i sprawdza go na tej odłożonej — a potem powtarza to, zmieniając części rolami. Tutaj podziały nie są losowe. Peptydy grupuje się najpierw według wspólnego motywu i całe grupy trafiają w całości do jednej części. Gdyby dzielić losowo, peptydy niemal identyczne wylądowałyby po obu stronach granicy i model byłby oceniany na zadaniu, które w praktyce już widział. Ten „wyciek" przez podobieństwo sekwencji to główny mechanizm zawyżania wyników w przewidywaniu wiązania i główny powód, dla którego liczby z walidacji krzyżowej bywają systematycznie lepsze niż wyniki na danych naprawdę nowych.

Dane, część pierwsza: probówka

Przez pierwsze piętnaście lat tej dziedziny dane pochodziły z pomiarów powinowactwa, czyli siły wiązania. Warto wiedzieć, jak dokładnie powstają, bo to tłumaczy, dlaczego jest ich tak mało.

Bierze się oczyszczoną cząsteczkę HLA — historycznie izolowaną z linii komórkowych homozygotycznych pod względem danego allelu, czyli takich, które mają dwie identyczne kopie genu, bo tylko one dają jednorodne białko. Do tego peptyd wzorcowy, o którym wiadomo, że wiąże się mocno, znakowany radioaktywnym jodem-125. Teraz dodaje się badany peptyd w rosnących stężeniach i sprawdza, przy jakim stężeniu wypiera on połowę peptydu wzorcowego z rowków. Ta wartość to IC50, podawana w nanomolach: im mniejsza, tym silniejsze wiązanie, bo tym mniej badanego peptydu wystarczyło. Konwencja IEDB mówi: poniżej 50 nM to wysokie powinowactwo, poniżej 500 nM pośrednie, poniżej 5000 nM niskie. Nowsza odmiana metody rezygnuje z izotopu — rekombinowane białko zwija się w obecności peptydu, a powstały kompleks wykrywa się świeceniem, w płytkach o 384 dołkach.

Te dane mają dwie wady, które trzeba wypowiedzieć wprost.

Po pierwsze, mierzą inne pytanie. Probówka z oczyszczonym białkiem nie wie, czy komórka w ogóle produkuje białko źródłowe, czy proteasom wytnie akurat ten fragment i czy TAP go przepuści. To pomiar pytania pierwszego, a interesuje nas drugie.

Po drugie, są nieliczne i skrzywione. Każdy pomiar to osobny eksperyment laboratoryjny trwający dni, a allele do badania wybierali ludzie, kierując się częstością w populacji i własnymi zainteresowaniami. Stąd 176 tysięcy pomiarów na 114 alleli i przytłaczająca nadreprezentacja HLA-A*02:01.

Dane, część druga: zapytać samą komórkę

Przełom przyszedł, gdy zamiast probówki zaczęto pytać komórkę. Metoda nazywa się immunopeptydomiką i sprowadza się do tego, żeby zdjąć peptydy z powierzchni żywych komórek i po prostu je odczytać. Procedura jest zaskakująco fizyczna, a warto ją prześledzić, bo prawie każde jej ograniczenie odkłada się później w modelu.

Zaczyna się od materiału, i to sporego: rzędu stu milionów komórek albo około grama tkanki. Komórki rozbija się łagodnym detergentem, uwalniając ich zawartość. Z powstałej zawiesiny trzeba teraz wyłowić same cząsteczki HLA — służy do tego przeciwciało W6/32, białko rozpoznające wszystkie cząsteczki HLA klasy I, unieruchomione na drobinkach wypełniających kolumnę. Zawiesina krąży przez kolumnę całą noc w 4 °C, a przeciwciało zatrzymuje kompleksy HLA razem z tkwiącymi w nich peptydami.

Potem złoże się przemywa i zalewa rozcieńczonym kwasem — trifluorooctowym albo octowym. Kwas rozbija kompleks, który uwalnia peptydy. Te oddziela się od dużo większych białek filtrem przepuszczającym tylko cząsteczki poniżej 3 kDa, zatęża i podaje do spektrometru mas — urządzenia, które waży cząsteczki tak dokładnie, że z masy da się odczytać skład aminokwasowy. Zmierzone widma porównuje się z widmami teoretycznymi wszystkich peptydów, jakie da się wyprowadzić z ludzkiego proteomu, i przyjmuje te dopasowania, które przechodzą kontrolę odsetka fałszywych odkryć — zwykle na poziomie 1–5%, czyli z góry przyjmując, że tyle wyników na liście będzie pomyłkami. Szczegóły tej procedury — użyty kwas, próg filtra, przyjęty odsetek — różnią się między pracowniami; powyżej opisaliśmy jeden z typowych wariantów.

Na wyjściu dostaje się listę peptydów, które naprawdę leżały w rowku na powierzchni żywej komórki. To jakościowo inne dane niż IC50: nie „ten peptyd potrafiłby się związać", tylko „ten peptyd tam był".

Jest tylko jeden kłopot, i to poważny.

Komórki z jednym zamkiem

Zwykła komórka nosi do sześciu różnych cząsteczek HLA klasy I naraz, a przeciwciało W6/32 zgarnia je wszystkie bez rozróżnienia. Dostajemy więc worek peptydów bez etykiet: wiadomo, że każdy był prezentowany, ale nie wiadomo, przez który z sześciu wariantów. Dla modelu, którego całym sensem jest zależność „ten rowek — te peptydy", takie dane są niemal bezużyteczne.

Rozwiązanie było kosztowne i skuteczne: wyhodować komórki mające tylko jeden zamek. Bierze się linię komórkową B721.221, która wskutek uszkodzenia genów nie produkuje własnego HLA klasy I w ogóle, i wprowadza do niej pojedynczy, wybrany allel. Wszystko, co potem z takiej komórki zdejmiemy, pochodzi z jednej i tej samej cząsteczki. Etykieta jest pewna z samej konstrukcji doświadczenia.

Jak czytać: oba panele mają ten sam układ — u góry fragment błony komórki z osadzonymi w niej cząsteczkami HLA, w środku pula peptydów zdjętych z tej komórki, na dole wyliczony z nich motyw. W panelu A komórka jest zwyczajna: sześć cząsteczek w trzech kolorach (kolor odpowiada genowi HLA-A, -B albo -C, każdy w dwóch kopiach), peptydy pomieszane, a motyw na dole rozmyty, bo nakłada się na siebie kilka różnych gustów naraz. W panelu B komórce wprowadzono jeden allel: peptydy są jednorodne, a motyw ostry — duże litery na pozycji 2 i 9 to kotwice. Im większa litera, tym silniejsza preferencja.

Pierwsza duża praca tego typu (Abelin i wsp., Immunity 2017) objęła 16 alleli i ponad 24 000 różnych peptydów — od 900 do 3550 na allel. Trzy lata później Sarkizova i wsp. (Nature Biotechnology 2020) rozszerzyli to do 95 linii monoallelicznych: 31 alleli HLA-A, 40 HLA-B, 21 HLA-C i 3 HLA-G, łącznie 186 464 peptydy, mediana 1860 na allel. Piętnaście z tych alleli nie miało wcześniej opisanego motywu w ogóle. Zestaw pokrywa co najmniej jeden allel u 95% ludzi na świecie — osobno dla genu A, B i C.

Ta jedna zmiana metodologiczna zrobiła dla dziedziny więcej niż jakakolwiek zmiana architektury sieci.

Dekonwolucja motywów: model, który sam etykietuje dane

Komórki monoalleliczne rozwiązują problem dla alleli, które ktoś zadał sobie trud wprowadzić do linii komórkowej. Zostaje jednak ogromny zasób, którego szkoda zmarnować: peptydy zdjęte z prawdziwych tkanek i guzów. Sam HLA Ligand Atlas to 90 428 ligandów klasy I z 29 rodzajów tkanek od 21 dawców. Są cenne właśnie dlatego, że pochodzą z żywej biologii, a nie z komórki przerobionej w laboratorium — i są nieodwracalnie wieloalleliczne.

Odpowiedzią jest dekonwolucja motywów, czyli rozplątanie mieszaniny na osobne składniki. W NetMHCpan-4.1 wbudowano ją wprost w procedurę uczenia, pod nazwą NNAlign_MA. Pomysł jest elegancki, bo zamiast omijać brak etykiet, każe modelowi dorobić je sobie samemu.

Jak czytać: po lewej pula peptydów zdjętych z próbki wieloallelicznej — szare, bo nie wiadomo, do którego allelu należą; znak zapytania oznacza właśnie ten brak. Strzałka prowadzi do modelu, czyli fioletowej ramki z siecią. Model ocenia każdy peptyd względem alleli obecnych w tej próbce i odsyła go do jednego z trzech pojemników po prawej — tam peptydy mają już kolory, czyli przypisanie. Fioletowa strzałka wracająca dołem to sedno pomysłu: na tak pokolorowanych danych model uczy się dalej i w następnym przebiegu przypisuje trafniej. Kółko ze strzałką oznacza, że pętla powtarza się przez cały trening.

Przebieg wygląda tak:

1. Rozgrzewka. Przez pierwsze 20 iteracji model uczy się wyłącznie na danych jednoallelicznych, czyli tych z pewnymi etykietami. Dopiero gdy ma z grubsza poprawne pojęcie o motywach, wolno mu cokolwiek etykietować samemu.
2. Przypisanie. Każdy peptyd z próbki wieloallelicznej ocenia się względem tylko tych alleli, które ta konkretna próbka faktycznie ma — najwyżej sześciu, a nie trzydziestu tysięcy. Peptyd trafia do allelu z najwyższą oceną. Przypisanie jest twarde: zwycięzca bierze wszystko.
3. Wyrównanie skal. Tu kryje się sedno. Oceny różnych alleli nie są porównywalne wprost, więc przed porównaniem przelicza się je na wartości wystandaryzowane — mierzone w odchyleniach od średniej, jaką ten allel daje losowym peptydom. Bez tego kroku allel, który z natury wystawia wyższe oceny, zagarnąłby wszystkie peptydy w każdej próbce.
4. Wygaszanie korekty. Na początku treningu statystyki potrzebne do tego przeliczenia są jeszcze niepewne, więc korektę wprowadza się stopniowo: jej siła zmienia się wraz z numerem iteracji i wygasa mniej więcej między iteracją 55 a 95.
5. Powtórka co epokę. Przypisanie wykonuje się od nowa w każdym cyklu uczenia. Im lepszy model, tym lepsze etykiety; im lepsze etykiety, tym lepszy model.

To ta sama logika co w klasycznym algorytmie EM: naprzemiennie zgaduj brakującą wartość i dopasowuj model. Zysk jest mierzalny — dla epitopów przypisanych do alleli całkowicie nieobecnych w danych jednoallelicznych metoda wypada około dwukrotnie lepiej od poprzedniczek, choć pokazano to na małym zbiorze obejmującym trzy allele. Model uczy się takiego allelu przez odejmowanie: skoro te peptydy nie pasują do pięciu znanych wariantów w danej linii komórkowej, muszą należeć do szóstego.

Dwie głowy jednej sieci

Zostaje pytanie, jak w jednym modelu pogodzić dwa rodzaje danych: pomiary powinowactwa z probówki i peptydy zdjęte z komórek. Odpowiedź jest zaskakująco prosta.

Sieć ma jedną warstwę ukrytą, ale dwa neurony wyjściowe — jeden zwraca przewidywane powinowactwo, drugi prawdopodobieństwo, że peptyd jest ligandem. Wagi między wejściem a warstwą ukrytą są wspólne; wagi między warstwą ukrytą a wyjściem są osobne dla każdego typu danych. W czasie treningu losuje się przykład z jednego albo drugiego zbioru: pomiar powinowactwa poprawia swoją głowę i warstwę wspólną, zdjęty peptyd — swoją głowę i tę samą warstwę wspólną.

Ta wspólna warstwa jest całym mechanizmem, dzięki któremu obie kolekcje uczą się nawzajem. Pomiary powinowactwa wnoszą szeroki przekrój alleli, w tym rzadkich; spektrometria mas wnosi prawdziwy sygnał prezentacji, zawierający w sobie cięcie proteasomem, transport i ilość białka w komórce. Reprezentacja w warstwie ukrytej musi obsłużyć jedno i drugie naraz.

%Rank: dlaczego surowa ocena kłamie

Załóżmy, że model działa i zwraca liczbę. Pojawia się pytanie, którego nie da się pominąć: czy ocena 0,6 dla HLA-A*02:01 znaczy to samo, co 0,6 dla HLA-B*57:01?

Nie znaczy. Allele różnią się nie tylko preferencjami, ale i „szerokością gustu": jedne wiążą szeroką klasę peptydów, inne są bardzo wybredne. Rozkłady ocen mają więc różne położenie i różny kształt, a jeden wspólny próg wycina z jednego allelu sensowną garść kandydatów, a z drugiego albo prawie nic, albo pół proteomu.

Jak czytać: obie połówki pokazują to samo — rozkłady ocen, jakie model wystawia peptydom, osobno dla dwóch alleli (niebieskiego i czerwonego). Oś pozioma to ocena, im dalej w prawo, tym wyższa; wysokość krzywej mówi, jak wielu peptydom przypadła dana ocena. W panelu A postawiono jeden wspólny próg (biała przerywana linia) i zacieniono to, co go przekracza: z czerwonego allelu przechodzi spora część, z niebieskiego prawie nic — ten sam próg znaczy więc dla obu coś zupełnie innego. W panelu B próg wyznaczono osobno dla każdego allelu tak, by odciąć z każdego tę samą górną część, 2%. Surowa wartość odcięcia jest dla każdego inna, a zielone pola są równe. Na tym polega %Rank.

Dlatego wynikiem nie jest surowa ocena, tylko %Rank — pozycja w rankingu wyrażona w procentach. Model ocenia najpierw duży zbiór losowych peptydów naturalnych dla danego allelu i zapamiętuje rozkład tych ocen jako tło. Kandydat dostaje potem nie swoją surową ocenę, tylko odpowiedź na pytanie „jaki procent losowego tła wypadł lepiej od ciebie". Wynik 0,5% znaczy więc: lepszy niż 99,5% losowych peptydów dla tego konkretnego allelu. Umowne progi to 0,5% dla wiążących silnie i 2% dla słabo.

To dokładnie ta sama sztuczka, którą widzieliśmy wewnątrz dekonwolucji — raz stosowana w treningu, żeby przypisania były sprawiedliwe, raz na wyjściu, żeby oceny były porównywalne. Ma ona konsekwencję, którą łatwo przeoczyć: %Rank mówi o pozycji w rankingu, nie o prawdopodobieństwie. Peptyd z wynikiem 0,1% nie ma dziesięciokrotnie większej szansy na prezentację niż peptyd z 1% — ma po prostu wyższą lokatę.

Trzy inne szkoły

NetMHCpan opisuje główny nurt, ale nie jedyny. Najciekawsze jest to, że konkurencyjne narzędzia rozwiązują te same trzy podproblemy — jak opisać allel, jak poradzić sobie ze zmienną długością peptydu i jak wycisnąć coś z danych wieloallelicznych — i za każdym razem robią to inaczej.

	opis allelu	zmienna długość	dane wieloalleliczne
NetMHCpan-4.1	34 reszty kontaktowe	rdzeń 9-literowy przez przeszukiwanie	NNAlign_MA w trakcie treningu
MHCflurry 2.0	37 reszt	trzy wyrównania sklejone w 45 pozycji	najlepsza ocena z alleli próbki
MixMHCpred	macierz pozycyjna	osobny model na każdą długość	MixMHCp przed treningiem
MHCnuggets	osobna sieć na każdy allel	LSTM, bez wyrównywania	transfer między allelami

MHCflurry 2.0 koduje rowek 37 pozycjami — tymi samymi 34 kontaktowymi co NetMHCpan plus trzema dodatkowymi, potrzebnymi do rozróżnienia par alleli, które inaczej miałyby identyczny opis. Zmienną długość rozwiązuje zaskakująco brutalnie: ten sam peptyd zapisuje trzy razy — dosunięty do lewej, wyśrodkowany i dosunięty do prawej — i skleja to w jedną sekwencję o stałej długości 45 pozycji. Zamiast szukać właściwego wyrównania, jak NetMHCpan, podaje sieci wszystkie trzy naraz i pozwala jej samej zdecydować, które są istotne.

Najważniejszy jego wkład jest jednak inny. MHCflurry dokłada osobny model przetwarzania antygenu, którego wejściem nie jest sam peptyd, lecz peptyd wraz z piętnastoma aminokwasami po każdej stronie w białku źródłowym. Powód jest biologiczny i autorzy formułują go wprost: to proteasom decyduje, gdzie przeciąć łańcuch, a skuteczność cięcia zależy od tego, co leży po obu stronach miejsca cięcia. Peptyd wyrwany z kontekstu tę informację traci. Model rzeczywiście ją znajduje: widać w nim niedobór proliny tuż przed peptydem i jej nadmiar na drugiej pozycji, co odpowiada znanemu działaniu enzymu ERAP, przycinającego peptydy przed załadowaniem do HLA.

Dwa uczciwe zastrzeżenia do tego pomysłu. Po pierwsze, zysk jest realny, ale skromny: średnio 3,3% poprawy. Po drugie, sposób połączenia obu składowych jest rozbrajająco prosty — końcowa ocena to regresja logistyczna o trzech parametrach, czyli formuła ważąca dwie liczby i dodająca stałą. Cała inteligencja siedzi w dwóch sieciach składowych; scalenie ich to jedna linijka statystyki.

MixMHCpred idzie w przeciwną stronę, ku prostocie. Zamiast sieci używa macierzy pozycyjnych: dla każdej pozycji w peptydzie i każdego z dwudziestu aminokwasów zapisuje jedną liczbę mówiącą, jak bardzo dany allel go w tym miejscu lubi. Ocena peptydu to suma tych liczb. Wybór nie jest lenistwem, tylko wnioskiem z biologii: ligandy klasy I nie wykazują silnych zależności między pozycjami — to, co siedzi na pozycji drugiej, prawie nie wpływa na to, co pasuje na dziewiątej. Założenie o niezależności, które macierz pozycyjna z konieczności czyni, jest tu więc bliskie prawdy.

Towarzyszące jej narzędzie MixMHCp rozwiązuje problem danych wieloallelicznych przed treningiem, a nie w jego trakcie: dopasowuje do mieszaniny kilka motywów naraz, przy czym każdy peptyd dostaje ułamkowe przypisanie do każdego z nich, a osobny „kosz" na motyw płaski wyłapuje zanieczyszczenia. Najsprytniejszy jest sposób przypisywania motywów do konkretnych alleli: algorytm wykorzystuje współwystępowanie alleli u różnych dawców. Jeśli dwie próbki mają wspólny dokładnie jeden allel, to motyw obecny w obu musi pochodzić właśnie od niego. Potem rozszerza te przypisania rekurencyjnie, na próbki różniące się jednym allelem.

Ciekawostka: najnowszy MixMHCpred 3.0 zatoczył koło. To hybryda, w której sieć neuronowa przewiduje macierz pozycyjną — a na wejściu dostaje te same 34 aminokwasy rowka, od których zaczęliśmy.

MHCnuggets rozwiązuje problem zmiennej długości inaczej niż wszyscy: warstwą typu LSTM o 64 jednostkach. To rodzaj sieci czytającej sekwencję litera po literze i pamiętającej, co widziała wcześniej — z natury przyjmuje więc wejście dowolnej długości i nie wymaga żadnego wyrównywania ani sklejania wariantów.

Za cenę rezygnacji z pan-specyficzności — tu jest osobna sieć dla każdego allelu, 148 dla klasy I — dostaje w zamian uczenie transferowe. Sieć bazową trenuje się na allelu najbogatszym w dane, czyli HLA-A*02:01, a jej wagi służą jako punkt startowy dla wszystkich pozostałych; zamiast uczyć się od zera, każdy kolejny allel zaczyna od czegoś, co już mniej więcej działa. Jeśli dla danego allelu lepszym punktem startu okaże się inny niż bazowy, procedura powtarza dostrajanie od tamtego. Transfer działa też w drugiej osi: najpierw model uczy się na pomiarach powinowactwa, potem przenosi wagi i doucza je na danych ze spektrometrii mas. Dla allelu, dla którego nie ma żadnych danych, wybiera się sieć allelu najbliższego według klasyfikacji supertypów, grupującej warianty o podobnym kształcie rowka.

Skąd wiadomo, że model jest dobry

To sekcja pomijana w popularnych opisach najczęściej, a rozstrzyga więcej niż wybór architektury.

Naturalnym odruchem jest zmierzyć AUROC. To popularna miara jakości, odpowiadająca na pytanie: jeśli wylosuję jeden peptyd prezentowany i jeden nieprezentowany, jaka jest szansa, że model da temu pierwszemu wyższą ocenę? Wartość 1,0 oznacza doskonałość, 0,5 — rzut monetą. Zaletą AUROC jest to, że nie zależy od proporcji jednych do drugich. I to samo jest jej wadą, bo w naszym zadaniu proporcja jest właśnie tym, co czyni je trudnym.

Zobaczmy to na liczbach. Ludzki proteom zawiera około 10 milionów możliwych fragmentów dziewięcioliterowych. Pojedynczy allel prezentuje ich rzędu dziesięciu tysięcy. Prezentowany jest więc mniej więcej jeden peptyd na tysiąc.

Weźmy teraz model naprawdę dobry: wychwytuje 90% prawdziwych ligandów i myli się tylko w jednym przypadku na sto peptydów nieprezentowanych. Puśćmy go na milion kandydatów, wśród których prezentowanych jest tysiąc. Trafień będzie 900. Ale fałszywych alarmów będzie 9990, bo jeden procent z 999 000 to prawie dziesięć tysięcy. Na liście, którą model zwróci, na jedno trafienie przypadnie jedenaście pomyłek; lista w 92% składa się ze śmieci. A AUROC takiego modelu byłby znakomity — bo AUROC tej listy w ogóle nie ogląda.

To nie jest wada modelu. To arytmetyka zdarzeń rzadkich — i dokładnie dlatego zbiory testowe w tej dziedzinie buduje się w proporcjach od 1:99 do 1:999, a nie po połowie.

Jak czytać: to schemat, nie prawdziwe dane. Oba panele pokazują ten sam model na dwóch różnych zbiorach testowych. U góry skład zbioru: po lewej pół na pół, po prawej jeden peptyd prezentowany na 99 nieprezentowanych — zielony pasek jest wtedy ledwie widoczny. W środku krzywa ROC, identyczna w obu panelach, na co wskazuje znak równości między nimi, bo ta miara nie zależy od proporcji. Na dole to, co naprawdę się zmienia: pierwsze dziewięć pozycji listy zwróconej przez model. Zielone kółka to trafienia, szare to pomyłki. Po lewej trafnych jest osiem na dziewięć, po prawej jedno.

Główną metryką jest więc wartość predykcyjna dodatnia, w skrócie PPV: jaki ułamek peptydów z czoła rankingu to prawdziwe ligandy. Jak silnie zależy ona od proporcji, widać na konkretnych liczbach — w jednym z badań ten sam NetMHCpan-4.1 osiąga PPV 0,791 przy proporcji 1:19 i 0,671 przy 1:99. Dwanaście punktów procentowych różnicy bez żadnej zmiany w modelu, wyłącznie z powodu zmiany składu zbioru testowego.

I tu dochodzimy do pułapki, która czyni większość porównań w tej dziedzinie bezwartościowymi. Skrót „PPV" oznacza w tej literaturze co najmniej trzy różne rzeczy. HLAthena i MHCnuggets liczą go przy proporcji 1:999, biorąc czoło 0,1% listy. MHCflurry liczy go przy 1:99, przy czym peptydy-atrapy dobiera z tych samych białek, z których pochodzą trafienia. NetMHCpan bierze czoło listy o długości równej 95% liczby ligandów, celowo zostawiając margines na zanieczyszczenia w danych. Wartość 0,42 raportowana przez MHCnuggets i wartość 0,83 raportowana przez NetMHCpan nie są tą samą wielkością i zestawianie ich w jednej tabeli nie ma sensu.

Że nie jest to czepianie się metodologii, pokazuje uwaga autorów najnowszej wersji MixMHCpred: na losowych atrapach „wartości AUC do 0,95 można uzyskać nawet przy stosunkowo niespecyficznych motywach". Model, który nie nauczył się prawie niczego o konkretnym allelu, wciąż wygląda na wykresie ROC znakomicie.

Jest też problem poważniejszy niż wybór metryki. Prawie każde opublikowane porównanie tych narzędzi przeprowadzili autorzy jednego z porównywanych narzędzi — i, co nie zaskakuje, w każdym takim porównaniu wygrywa narzędzie gospodarza. Bywa i tak, że jedno trzeba z benchmarku wykluczyć, bo jego zbiór treningowy zachodzi na testowy; przydarzyło się to MHCflurry w jednej z takich prac. Wyjątkiem jest automatyczny benchmark IEDB, prowadzony na bieżąco deponowanych danych — i podsumowanie po ośmiu latach jego działania jest otrzeźwiające: czołowe metody okazały się statystycznie nierozróżnialne, a nowa metoda musi czekać około czterech lat, zanim uzbiera się dość danych, by dało się ją wiarygodnie ocenić.

Najbardziej wiarygodny sprawdzian to taki, w którym peptydy uznane za negatywne naprawdę miały szansę okazać się pozytywne. W jednym z takich badań przetestowano doświadczalnie 220 peptydów wirusa krowianki u myszy. Wynik jest zarazem imponujący i pokorny: najlepsze metody wyłapały ponad połowę najważniejszych epitopów w obrębie 0,04% wszystkich predykcji — czyli w pierwszych mniej więcej 280 pozycjach z 767 788. Żeby wyłapać 90%, trzeba było zejść do 1,3–1,5% listy.

I jeszcze jedno zdanie, które autorzy NetMHCpan-4.1 napisali o własnym narzędziu, a które jest najuczciwszym w tej literaturze. Wersja 4.1 wyraźnie pobiła 4.0 w przewidywaniu peptydów wykrywanych spektrometrem — ale w przewidywaniu prawdziwych epitopów limfocytów T wypadła porównywalnie z poprzedniczką, z konsekwentną poprawą tylko dla cząsteczek HLA-B i HLA-C. Bycie lepszym w zgadywaniu, co leży na powierzchni komórki, to nie to samo, co bycie lepszym w zgadywaniu, co zaatakuje limfocyt. To znów nasze trzy pytania i granica między drugim a trzecim.

Czego te modele nadal nie widzą

Negatywów nie ma. Spektrometria mas zwraca wyłącznie listę peptydów, które wykryto. Brak w wyniku może znaczyć „nie było" albo „było, ale się nie zmierzyło". Wszystkie negatywne przykłady treningowe są więc przyjęte, a nie zaobserwowane — to losowe fragmenty białek, o których się zakłada, że prezentowane nie były. Założenie jest w większości prawdziwe i w całości niesprawdzone.

I tu dochodzimy do liczby z poprzedniego artykułu, którą trzeba sprostować. Napisaliśmy, że NetMHCpan-4.1 wytrenowano na 13 245 212 punktach danych. Cytat jest wierny, ale to nie są pomiary. Rzeczywistych peptydów zmierzonych w laboratorium jest ponad 850 tysięcy; cała reszta to losowo dobrane peptydy naturalne z bazy UniProt, przyjęte za negatywne — po pięć razy tyle, ile wynosi liczba peptydów najczęstszej długości w danym zbiorze, i to osobno dla każdej z siedmiu długości. Przyjęte negatywy stanowią więc mniej więcej dziewięćdziesiąt cztery procent zbioru treningowego. To nie jest zarzut wobec metody, bo inaczej się nie da — ale liczba „13 milionów" sugeruje skalę pomiarową, której nie ma.

Spektrometr ma własne upodobania, i to zależne od allelu. Peptydy zawierające cysteinę są systematycznie niedowykrywane, bo cysteina łatwo się utlenia i skleja z sąsiadami. Że to artefakt metody, a nie biologia, pokazał elegancki test kontrolny: w danych z przesiewu genetycznego cysteina występuje z oczekiwaną częstością, a w danych ze spektrometru jest zubożona pięcio- do dziesięciokrotnie. Poprawne jej uwzględnienie zwiększa liczbę przewidywanych ligandów o 9–21%. Jeszcze mocniejszy jest przykład hydrofobowości: sama zmiana stężenia rozpuszczalnika przy zmywaniu peptydów ze złoża podwoiła liczbę wykrytych peptydów — przy czym dla HLA-A*02 liczba znalezionych ligandów wzrosła ponad dwukrotnie, a dla HLA-A*30 spadła o 25%. Zmiana jednego parametru chemicznego przesunęła więc pozorną wielkość repertuaru jednego allelu względem drugiego. Model uczony na takich danych dziedziczy to skrzywienie i traktuje je jak immunologię. Autorzy NetMHCpan piszą o tym wprost: nadreprezentowane są peptydy dobrze mierzalne, a cysteinowe pomijane.

Ekspresji w wejściu nie ma. Klasyczny model dostaje peptyd i allel, i nic więcej. Nie wie, jak intensywnie dany gen jest w tym guzie odczytywany ani z jakiego białka fragment pochodzi. A wiadomo, że obfitość białka źródłowego silnie wpływa na to, czy jego fragmenty w ogóle trafią na powierzchnię. Modele uwzględniające ekspresję istnieją — o nich był Etap 4 poprzedniego artykułu — ale wymagają odczytu aktywności genów u konkretnego pacjenta i przez to nie działają jako uniwersalne narzędzie „peptyd na wejściu, ocena na wyjściu".

Ogon wciąż jest ogonem. Pan-specyficzność pozwala ocenić allel bez ani jednego przykładu treningowego, ale taka ocena jest przewidywaniem przez analogię, nie wiedzą. Autorzy sami raportują gorsze wyniki dla cząsteczek o skąpych danych, zwłaszcza HLA-C, i wskazują dwie przyczyny: mniejszą liczbę tych cząsteczek na powierzchni komórki oraz to, że użyte przeciwciało samo preferuje pewne geny. Narzędzie, którym zbiera się dane, współdecyduje więc o tym, których alleli model nigdy dobrze nie pozna.

Prezentacja to nie rozpoznanie. Nawet doskonały model prezentacji nie odpowiada na pytanie trzecie. Peptyd może być bez zarzutu wystawiony i nie wywołać żadnej reakcji, bo pacjent nie ma pasującego receptora albo jego układ odpornościowy nauczył się ten kształt tolerować.

Co z tego wynika

Model prezentacji antygenu robi jedną rzecz i robi ją dobrze: z listy tysięcy kandydatów wyławia te kilkadziesiąt, które warto sprawdzić dalej. Nie mówi, że zadziałają — mówi, że reszty nie warto badać. Przy koszcie sprawdzenia jednego peptydu na komórkach pacjenta to właśnie jest cała wartość.

Warto też zauważyć, skąd w tej historii brał się postęp. Nie z coraz większych sieci — przypomnijmy, że mowa o modelu z jedną warstwą ukrytą i sześćdziesięcioma kilkoma neuronami, czyli o czymś, co dzisiejszy student uczenia maszynowego uznałby za zabawkę. Trzy rzeczy zmieniły tę dziedzinę najbardziej: opisanie zamka jako części wejścia modelu, wyhodowanie komórek z jednym allelem i nauczenie modelu dorabiania sobie brakujących etykiet. Pierwsza to pomysł na reprezentację, druga to eksperyment biologiczny, trzecia to procedura uczenia. Architektura sieci jest w tym zestawieniu najmniej ciekawą zmienną — i to jest, jak sądzimy, najbardziej pouczający wniosek z całego tego etapu.

---

Źródła

1. Reynisson B. i wsp., NetMHCpan-4.1 and NetMHCIIpan-4.0: improved predictions of MHC antigen presentation by concurrent motif deconvolution and integration of MS MHC eluted ligand data, Nucleic Acids Research 2020 — academic.oup.com
2. Alvarez B. i wsp., NNAlign_MA; MHC peptidome deconvolution for accurate MHC binding motif characterization and improved T-cell epitope predictions, Molecular & Cellular Proteomics 2019 — pmc.ncbi.nlm.nih.gov
3. Jurtz V. i wsp., NetMHCpan-4.0: Improved Peptide–MHC Class I Interaction Predictions Integrating Eluted Ligand and Peptide Binding Affinity Data, Journal of Immunology 2017 — pmc.ncbi.nlm.nih.gov
4. Nielsen M. i wsp., NetMHCpan, a method for quantitative predictions of peptide binding to any HLA-A and -B locus protein of known sequence, PLoS ONE 2007 (definicja pseudosekwencji) — pmc.ncbi.nlm.nih.gov
5. Andreatta M., Nielsen M., Gapped sequence alignment using artificial neural networks, Bioinformatics 2016 (rdzeń 9-aminokwasowy) — academic.oup.com
6. Abelin J.G. i wsp., Mass Spectrometry Profiling of HLA-Associated Peptidomes in Mono-allelic Cells Enables More Accurate Epitope Prediction, Immunity 2017 — pmc.ncbi.nlm.nih.gov
7. Sarkizova S. i wsp., A large peptidome dataset improves HLA class I epitope prediction across most of the human population, Nature Biotechnology 2020 — pmc.ncbi.nlm.nih.gov
8. O'Donnell T.J., Rubinsteyn A., Laserson U., MHCflurry 2.0: Improved Pan-Allele Prediction of MHC Class I-Presented Peptides by Incorporating Antigen Processing, Cell Systems 2020 — cell.com
9. Bassani-Sternberg M. i wsp., Deciphering HLA-I motifs across HLA peptidomes improves neo-antigen predictions and identifies allostery regulating HLA specificity, PLoS Computational Biology 2017 (MixMHCpred, MixMHCp) — pmc.ncbi.nlm.nih.gov
10. Tadros D.M., Racle J., Gfeller D., Predicting MHC-I ligands across alleles and species: how far can we go?, Genome Medicine 2025 (MixMHCpred 3.0; uwaga o AUC 0,95) — pmc.ncbi.nlm.nih.gov
11. Shao X.M. i wsp., High-Throughput Prediction of MHC Class I and II Neoantigens with MHCnuggets, Cancer Immunology Research 2020 — pmc.ncbi.nlm.nih.gov
12. Marcu A. i wsp., HLA Ligand Atlas: a benign reference of HLA-presented peptides to improve T-cell-based cancer immunotherapy, Journal for ImmunoTherapy of Cancer 2021 — pmc.ncbi.nlm.nih.gov
13. Kim Y. i wsp., Dataset size and composition impact the reliability of performance benchmarks for peptide-MHC binding predictions, BMC Bioinformatics 2014 (zbiór BD2013) — pmc.ncbi.nlm.nih.gov
14. Trevizani R. i wsp., A comprehensive analysis of the IEDB MHC class-I automated benchmark, Briefings in Bioinformatics 2022 — academic.oup.com
15. Paul S. i wsp., Benchmarking predictions of MHC class I restricted T cell epitopes in a comprehensively studied model system, PLoS Computational Biology 2020 (walidacja na myszach) — pmc.ncbi.nlm.nih.gov
16. Solving an MHC allele-specific bias in the reported immunopeptidome, JCI Insight 2020 (skrzywienie hydrofobowe) — insight.jci.org
17. Hashemi N. i wsp., Improved prediction of MHC-peptide binding using protein language models, Frontiers in Bioinformatics 2023 (PPV przy 1:19 i 1:99) — pmc.ncbi.nlm.nih.gov
18. High-throughput, targeted MHC class I immunopeptidomics using a functional genetics screening platform, Nature Biotechnology 2023 (EpiScan; kontrola dla cysteiny) — nature.com
19. IPD-IMGT/HLA — statystyka nazwanych alleli, stan na czerwiec 2026 — hla.alleles.org

Opisane tu narzędzia są oprogramowaniem badawczym, a nie wyrobem medycznym — służą zawężaniu listy kandydatów w pracy naukowej, nie podejmowaniu decyzji klinicznych.